2016년도 핵심연구 연차‧실적계획서(협약용)

<표>

※ 전자접수이므로 주관연구책임자 및 주관연구기관장 서명(인, 직인)은 생략가능

<표>

「중견연구(핵심연구) 협약연구기간 적용 안내」

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〈 국 문 요 약 문 〉

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〈 영 문 요 약 문 〉

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〈 보 안 성 검 토 〉

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〈 심 사 및 전 문 분 과 〉

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〈 연 구 분 야 〉

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※ 통합연구지원시스템(http://ernd.nrf.re.kr)의 “연구분야코드검색” 메뉴에서 본 과제와 가장 관련된다고 생각되는 최하위 분야코드를 입력

- 분야코드는 반드시 소분류 분야코드를 기재함 (중분야 분야코드 입력시 업로드 에러 발생)

- 단, 국가과학기술표준분류(적용분야)는 “코드검색” 메뉴에서 제시되는 공공분야(12개) 및 산업분야(20개) 중 가장 관련되는 것의 대분류 분야코드를 입력

※ 중심분야는 필수 입력사항이며, 관련분야1과 관련분야2는 선택 입력

※ 각각 분류표의 비중의 가로 합계는 100%가 되도록 작성 (가로 합계 100% 미준수시 업로드 에러 발생)

※ 원천기술개발분야는 입력하지 않으셔도 됩니다.

〈 주 관 연 구 책 임 자 이 력 사 항 〉

(1) 인적사항

<표>

※ 주관연구책임자의 국문성명과 연구자등록번호만 기재함

※ 연구자등록번호 확인 : 한국연구업적통합정보(KRI : www.kri.go.kr) 접속 → ‘연구업적등록’ 클릭 → 기본정보 탭에서 확인

※ 기재된 인적사항에 기반하여, 협약통보 등이 이루어지므로 반드시 한국연구업적통합정보 기본정보 업데이트 요망

※ 인적사항 기재시 연구자 번호 오기에 주의

(2) 학력사항

<표>

※ 학위 : 최종학위만 입력함

(3) 경 력

<표>

※ 연도 (예: 2014) 표시 다음에 마침표를 찍지 않음

(4) 수상 경력

<표>

※ 연도 (예: 2014) 표시 다음에 마침표를 찍지 않음

(5) 국내외 학(협)회 활동

<표>

※ 연도 (예: 2014) 표시 다음에 마침표를 찍지 않음

(6) 대표적 연구실적

<표>

※ 대표적실적은 전체연구실적 중 5건을 기재하셔야 하며, 최근 5년간(2011.5.1.부터) 발표된 실적(논문, 특허 등)을 3건 이상 포함하여야 함. 예를 들어, 5건 전체를 2011년 이후 실적으로 작성해도 되고, 2011년 이후 실적은 3건, 나머지 2건은 2011년 이전 실적으로 작성해도 무방함. 논문의 경우에는 게재가 확정된 것까지 포함하며, 특허의 경우에는 등록된 것에 한함.

- 과제 시작 후 대표적실적 위주로 기재 요망

※ 게재지는 반드시 정식명칭을 기재하도록 함(약어 사용 금지)

※ 비고에는 피인용횟수나 우수논문수상 등 특별히 기술할 필요가 있는 사항을 기재

※ Impact Factor는 JCR 2014, 피인용 횟수는 Web of Science를 기준으로 작성 (다른 기준을 사용할 경우, 반드시 비고란에 기준을 명시)

(7) 최근 5년간의 연구실적(6번항의 대표적 논문/특허 실적 이외의 실적)

<표>

※ 논문의 경우에는 게재가 확정된 것(accepted, in press) 포함하며, 특허의 경우에는 등록된 것에 한함.

※ 게재지는 반드시 정식명칭을 기재하도록 함(약어 사용 금지)

※ 비고에는 피인용횟수나 우수논문수상 등 특별히 기술할 필요가 있는 사항을 기재

※ 상기 양식이 부족할 경우 양식을 복사해서 계속 사용 가능

※ Impact Factor는 JCR 2014, 피인용 횟수는 Web of Science를 기준으로 작성 (다른 기준을 사용할 경우, 반드시 비고란에 기준을 명시)

(8) 최근 5년간의 기타 실적

<표>

※ 최근 5년간(2011.5.1.부터) 논문/특허 이외의 연구업적(국제학회 초청강연, 국제학술지 편집위원 참여, 기술이전, 저서 등)을 기재

※ 상기 양식이 부족할 경우 양식을 복사해서 계속 사용 가능

(9) 최근 5년 이내에 종료된 국가 R&D 과제의 수행 현황

(단위 : 천원)

<표>

※ 성명과 연구자등록번호는 기재하지 않음

※ 연구개시일(2016.5.1) 기준 연구책임자가 ‘연구책임’ 및 ‘공동연구’ 이상 참여하여 종료된 타 연구사업 현황 기재

※ 총연구비는 연구책임자에게 전체 연구기간 동안 할당된 연구비를 천원단위로 입력하고 천원이하는 절사

※ 총참여개월수는 전체 연구기간 동안 참여한 개월수를 기재

※ 평균참여율=(1차년도 참여율+2차년도 참여율+…+종료년도 참여율)/총 참여기간(정수로 입력하며, “%” 입력시 오류 발생)

〈 타 연 구 사 업 수 행 현 황 〉

(단위 : 천원)

<표>

※ 성명과 연구자등록번호는 기재하지 않음

※ 연구책임자가 연구개시일(2016.5.1) 기준으로 수행하고 있는 타 연구사업 현황을 기재함

※ 참여유형 (택1) : 연구책임, 공동연구

- 연구책임 : 주관연구책임자, 협동연구책임자, 총괄연구책임자, 세부과제책임자 등 연구과제 책임자로 참여한 경우

- 공동연구 : 공동연구원, 협동연구원 등으로 참여한 경우

※ 참여시작일과 종료일은 연구책임자 또는 공동연구원이 참여한 전체기간을 작성함

※ 참여개월수는 당해연도의 참여개월수를 기재하고, 참여율은 정수만 입력(“%” 입력시 에러 발생)

※ 당해년도 연구비는 연구책임자 또는 공동연구원에게 할당된 연구비만을 천원단위로 입력하고 천원이하는 절사

< 이 연구 개발 과제와 동일 또는 유사한 과제를 타 기관에 신청하였을 경우 >

<표>

<여성 참여 인력 비율>

(단위 : 명, %)

<표>

〈 연 구 내 용 〉

<표>

1. 기 수행 연구실적

가. 당초 연구 목표 및 연차점검의 주요 착안점

1) 당초 연구 목표(제 1차 년도): 초 고감도 MR/Optical 이중 영상 조영제 개발

(1) 줄기 킬레이트(H4L) 설계 및 합성(Scheme 1)

(2) 유기 초분자 및 고분자 킬레이트 합성(Figures 1-3)

Figure 1. Some representative supramolecular architechtures of H4L's

Figure 2. Some representative linear homo- and copolymers of H4L's

Figure 3. Some representative cyclic homo- and copolymers of H4L's

(3) 무기 초분자 및 고분자 착물 합성(Figures 4-6)

Figure 4. Some examples of homometallic supramolecular architechtures

Figure 5. Examples of homo- and heterometallic linear coordination polymers

Figure 6. Examples of homo- and heterometallic cyclic coordination polymers

2) 연차 연구의 주요 착안점

(1) 줄기 킬레이트(HnLm)의 합성 여부

(2) 줄기 킬레이트를 포함하는 상자기성 금속 착물(ML)의 합성 여부(M: Gd 또는 Mn)

(3) 상자기성 금속 착물(ML)의 자기적 특성 연구

나. 연구범위 및 연구수행 방법

1) 줄기 킬레이트(HnLm)의 합성

간(liver)이나 혈관(blood-pool) 조영 또는 암 표적성 치료 효능을 지닐 것으로 예상되는 다기능 킬레이트 네 종류(L1 - L4)를 합성하였

다(Chart 1):

(1) 킬레이트 L1(= EDTA-BTA) 합성(Scheme 1)

① 킬레이트 L1은 EDTA-benzothiazoleaniline (EDTA-BTA) conjugate 화합물로서, BTA는 항균, 항말라리아, 항바이러스, 항암효과

등 다양한 생물학적 특성을 가지고 있는 것으로 익히 알려져 있다.

② 따라서 킬레이트 L1은 상자성 금속(Mn2+, Gd3+)과 착물을 형성할 때, 자기 영상과 항암 효능을 동시에 지니는 이른바 theranostic

MRI CA가 될 것으로 기대된다.

(2) 킬레이트 L2(= DO2A-BTA conjugate 합성(Scheme 2)

① 킬레이트 L2는 DO2A-benzothiazoleaniline (DO2A-BTA) conjugate 화합물로서, DO2A는 cyclen을 모체로 하는 거대고리 킬레이드

로서, 망간이나 가돌리늄 등과 금속 착물을 형성하였을 때 L1에 비해 화학적 및 동력적 안정성을 보여줄 것으로 기대된다.

② 고리 골격의 질소 원자에 다양한 생화학적 및 의약적 응용성 지니는 유도체를 도입할 수 있다.

(3) 킬레이트 L3(= 1,4,7,10,13,16-hexaazaoctadecane-1,4,14-tricarboxylic acid 합성(Scheme 3)

킬레이트 L3는 아래에서 보는 바처럼, 중합 반응이 가능한 acryloyl 그룹을 질소 고리 원자에 도입하여 이로부터 초분자 및 고분자 킬

레이트 합성이 가능하도록 설계했다.

(4) 킬레이트 L4(= 2,2’-(4,10-diacryloyl-1,4,7,10-tetrazacyclododecane-1,7-diyl)diacetic acid 합성(Scheme 4)

① 킬레이트 L4는 전형적인 12-ane N4 구조의 거대 고리 화합물로서, L3에 비해 착물 안정화 상수는 물론 체내에서의 반응속도론적

안정도 역시 훨씬 더 클 것으로 기대된다.

② 이 화합물의 구조적인 특징은 두 개의 acryloyl 작용기가 있어, 다른 고분자와의 결합 반응은 물론, 스스로 고분자 중합반응을 일으

킬 수 있도록 설계 및 합성하였다는 데 있다.

2) 상자성 금속 착물의 합성(Chart 2)

(1) 위에서 합성한 새로운 일련의 다중성 킬레이트(L1-L4)(Schemes 1-4)를 사용하여 아래에 도시한 바처럼, 상자기성(paramagnetism)

을 지니는 두 종의 망간 화합물과 두 종의 가돌리늄 화합물을 합성하였다(Scheme 5).

(2) [Mn(L)(H2O)] (L = L1, L2)의 경우, BTA의 존재로 말미암아 영상과 치료가 동시에 가능한 소위 “theranostic MRI CA”의 기능을

할 것으로 기대될 뿐만 아니라, BTA의 친 지질성(lipophilicity)으로 간이나 혈관 조영제(blood-pool CA)의 기능을 할 수도 있을 것으

로 기대된다.

(3) 또한 두 망간 화합물은 킬레이트의 차이로 인해서 단순히 열역학적 및 반응속도론적 안정성에 상당한 차이를 보여줄 뿐만 아니라,

생체 내에서 상당히 다른 생물학적 분포(biodistribution)를 보여줄 것이다(참고. “연구수행 내용 및 결과”).

3) 상자기성 금속 착물(ML)의 특성 연구

(1) 자기 이완도(relaxivity) 측정: 각 착물의 자기이완도(r1, r2 mM-1s-1)를 측정하였고, 이를 기존의 상용화 된 유사 조영제들의 값들과

비교하였다.

(2) 반응속도론적 안정성(kinetic inertness): 합성한 착물들의 생체 내에서의 안정성, 즉 생체 이온들(Zn2+, Ca2+, 등)과의 교환반응

(transmetallation) 속도를 비교 분석하였다.

(3) in vivo 실험: 일부 착물에 대한 생체 내 거동, 즉 생화하적 분포(biodistribution)나 배출 경로(excretion pattern) 등에 대한 실험을

수행하였다.

다. 연구수행 내용 및 결과

1) 킬레이트(L1-L4) 합성 및 확인

(1) L1(참고. Scheme 1)

L1은 다음과 같은 일련의 중간체 합성 경로를 통하여 최종 합성 되었다:

① 2,3-Bis-tert-butoxycarbonylamino-propionic acid (1).

2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide (5g, 27mmol)에 NaHCO3 (9.07 g, 108 mmol)을 증류수 (108 mL)에 녹인 후, ice-bath를 설치하여 0 ℃로 식혀준다. 이 용액에 1,4-Dioxane (67.5 mL)에 녹인 di-tert-butyl dicarbonate (14.73 g, 67.5 mmol)을 천천히 가한다. 같은 온도에서 혼합 용액을 30분 동안 교반시켜 준 후, 상온에서 다시 하룻밤 동안 교반시킨다. 이후 혼합물을 다시 0℃로 만든 후, 염산 수용액(3 M)을 이용하여 pH가 2-3으로 유지시킨다. 반응 후, 유기층을 추출 하여, MgSO4로 수분을 제거한다. 반응 생성물은 감압 여과 후 용매를 제거하여 무색 오일로 얻는다. 생성물은 얇은 층 크로마토그래피 방법으로 부탄올/물/아세트산(8:1:1)의 전개액에서 확인 하였고, Ninhydrin(2%)을 포함하는 알콜 용액을 검출에 이용하였다. 이를 감압 건조하여 흰 색 고체를 얻는다. Yield: 7.8g (95%). 1H NMR (CDCl3): δ = 1.45 (s, 18H, CH3), 3.55 (m, 2H, CH2), 4.12 (s, 1H, CH), 4.27–5.17 (m, 1H, NH), 5.85 (s, 1H, OH), 2.05 (s, 1H, NH). Anal. Calcd for C13H24O6N2·2EtOAc: C, 51.71; H, 8.04; N, 8.10. Found: C, 51.87; H, 8.15; N,7.75.

② [2-(4-Benzothiazol-2-ylphenylcarbamoyl)-2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl] -carbamic acid tert butyl ester (2)

Pyridine(40 mL)에 녹인 2, 3-bis-tert-butoxycarbonylamino-propionic acid (1) (7.00 g, 23.01 mmol)과 피리딘(20 mL)에 녹인 benzothiazole aniline (5.20 g, 23.01 mmol)을 천천히 가한다. 혼합 용액을 10분간 교반한 후에, triphenyl phosphite (7.13 ml, 23.01 mmol)를 첨가한다. 반응 용액을 3시간 동안 80℃에서 교반한 후, 상온에서 밤새 교반시킨다. 이 기간 중에 생성된 침전을 분리하여, 증류수와 아세톤으로 씻은 후, acetonitrile을 사용하여 재결정하여 백색 고형물을 얻는다. Yield : 9.6 g (81.4%), Anal. Calcd for C26H32N4O5S: C, 60.92; H, 6.29; N, 10.93; S, 6.26. Found: C, 60.05; H, 6.36; N, 10.60; S, 5.98. 1H NMR (CDCl3): δ = 9.28 (s, 1H, NH) 8.06−8.01 (m, 3H, BTA), 7.89−7.85 (d, 1H, BTA), 7.68−7.64 (d, 2H,BTA), 7.49−7.44 (t, 1H, BTA), 7.38−7.33 (t, 1H, BTA), 5.97-5.93 (s, 2H, NH), 4.02−3.98 (d, 1H, CH) 3.57-3.41 (m, 2H, CH2), 1.50-1.40(d,18H,CH3).

③ 2,3-Diamoniumtrifluoroacetate-N-(4-benzothiazol-2-yl-phenyl)-propionamide (3)

[2-(4-benzothiazol-2- ylphenylcarbamoyl)-2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl]-carbamic acid-tert-butyl ester(1.5 g, 2.92 mmol)를 0℃로 유지한 CH2Cl2 (20 mL)에 녹인다. 이 용액에 trifluoroacetic acid (10 ml)를 천천히 가한다. 용액의 색깔이 노란색으로 변했다. 이 용액에 ether를 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 ether로 세 번 더 세척하고, 여과하여 연한 노란색의 고형물을 얻는다. Yield: 0.82g (90%), 1H NMR (MeOH-d4): δ = 8.75 (s, 1H, NHO), 8.01−7.99 (d, 2H, BTA), 7.9−7.89 (d, 2H, BTA), 7.82−7.78 (d, 2H, BTA), 7.45 (t, 1H, BTA), 7.35 (t, 1H, BTA), 4.43 (t, 1H, CH), 3.62−3.55 (dd, 1H, CH2), 3.51-3.44 (dd, 2H, CH2), 1.94 (s, 2H, NH). Anal. Calcd for C16H16N4OS: C, 44.45; H, 3.36; N, 10.37; S, 5.93. Found: C, 43.43; H, 3.54; N, 10.28; S, 5.56.

④ {[1-(4-Benzothiazol-2-yl-phenylcarbamoyl)-2-(bis-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-

tert-butoxycarbonylmethyl-amino}-acetic acid tert-butyl ester (4)

2,3-diamoniumtrifluoroacetate-N-(4-benzothiazole-2-yl-phenyl)-propionamide (2 g, 3.70 mmol), diisoppropylethylamine (7.66 mL, 59.2 mmol), 그리고 potassium iodide(1.84 g, 11.1 mmol)를 dimethyl formaimde (20 mL)에 녹여, 45℃에서 교반한다. 이 용액에 tert-butyl bromoacetate (5.77 mL, 29.6 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 가한다. 용액을 110℃에서 4시간 더 교반한 후, 상온으로 식힌다. 용매를 제거한 후, NaHCO3 용액(10%)과 ethyl acetate로 추출한다. 물 층을 ethyl acetate로 세 번 정도 더 추출하는 것을 반복하여 유기층을 Na2SO4을 첨가하여 수분을 제거한 후 용매를 제거하고, 이를 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하면 (SiO2, hexane/EtOAc = 9:1) 진한 갈색의 오일을 얻는다 (33.7 g, 82%). 1H NMR (CDCl3): δ = 10.85 (s, 1H, NH), 8.08−8.01 (m, 3H, BTA), 7.91−7.82 (dd, 3H, BTA), 7.47 (t, 1H, BTA), 7.36 (t, 1H, BTA), 3.75 (t, 1H, CH), 3.62−3.40 (m, 8H, CH2-tBu), 3.04-2.96 (dd, 2H, CH2), 1.46 (s, 36H, t-Bu). Anal. Calcd for C40H56N4O9S·3H2O: C, 58.37; H, 7.59; N, 6.81; S, 3.90; Found: C, 58.61; H, 7.31; N, 6.46; S, 3.58.

⑤ {[1-(4-Benzothiazol-2-yl-phenylcarbamoyl)-2-(bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-acetic acid (5)

화합물 4 (1.5 g, 1.95 mmol)를 acetonitrile (30 mL)에 녹여 HCl (36%, 15mL)을 5분간 0℃를 유지하면서 첨가하고, 상온에서 20시간 동안 교반하여준다. HCl (36%, 15mL)을 더 첨가하고 한 시간 더 교반하여준다. 진공 회전 농축기를 이용하여 전체 용액의 부피를 75% 줄이고, 물 30 mL를 첨가한 후, NaOH (1M)을 조금씩 첨가하여 pH를 1.6으로 맞춘다. 생성되는 하얀 침전물을 필터로 걸러내고 물(pH= 1.6), Et2O(30 mL), EtOAc(30 mL)로 씻어내어 하얀 파우더를 얻는다. Yield: 0.89 g (83%). 1H NMR (CDCl3): δ = 8.06−8.01 (m, 2H, BTA), 7.99−7.96 (d, 2H, BTA), 7. 85−7.83 (d, 2H, BTA), 7.52-7.49 (t, 1H, BTA), 7.42−7.39 (t, 1H, BTA), 5.50-5.48 (s, 2H, OH), 4.02−3.98 (d, 1H, CH), 3.96−3.76 (m, 8H, CH2), 3.57-3.41 (m, 2H, CH2), Anal. Calcd. for C24H24N4O9S·H2O): C, 51.24; H, 4.66; N, 9.96; S, 5.70. Found: C, 51.02; H, 4.65; N, 9.54; S, 5.54. HR-FABMS (m/z): calcd for C24H25N4O9S, 545.13 ([M+H]+); found, 545.13 ([M+H]+).

(2) L2(참고. Scheme 2)

L2는 다음과 같은 일련의 중간체 합성 경로를 통하여 최종 합성 되었다:

① di-tert-Butyl 2,2'-(4-(2-((4-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenyl)amino)-2-oxoethyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,7-diyl)diacetate (2)

화합물 1 (3.46 g, 8.64 mmol)을 dimethylformaide (16 mL)에 녹이고, NaHCO3 (0.56 g, 6.6 mmol)을 첨가하여 교반하여 준다. 위 플라스크에 N-(4-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenyl)-2-chloroacetamide (2 g, 6.66 mmol)을 dimethylformamide (10 mL)에 녹여 5분 동안 천천히 적가한다. 반응 용액을 상온에서 24시간 동안 더 교반한 후 반응을 완료시킨다. 용매를 감압 하에 제거하고, 침전물을 얻기 위하여 남은 오일에 acetone(100 mL)을 가한다. 여과액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 2를 노란색 가루를 얻는다(CH2Cl2 : MeOH = 98 : 2). Yield: 1.53g (35%). 1H NMR (CDCl3): δ = 10.30 (s, 1H, NH), 7.96 (s, 3H, BTA), 7.85 (t, J=7.5Hz, 3H, BTA), 7.55 – 7.21 (m, 2H, BTA), 3.72 (s, 2H, CH2), 3.27 (s,4H,2xCH2), 3.08 (d, J=27.2Hz, 8H, 4xCH2), 2.93 (d, J=26.3Hz, 8H, 4xCH2), 1.44 (d, J=5.8Hz, 1H, NH), 1.41 (s, 18H, 6xCH3). HR-FABMS (m/z): calcd for C35H51N6O5S, 667.3642 ([M+H]+); found, 667.3643 ([M+H]+).

② 2,2'-(4-(2-((4-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenyl)amino)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraaza- cyclo-dodecane-1,7-diyl)diacetic acid (3)

둥근 바닥 플라스크(100 mL)에 화합물 2 (1.5 g, 2.25 mmol)을 넣고, CH2Cl2 (20 mL)을 첨가하여 녹인다. Trifluoroacetic acid (20 mL)을 천천히 첨가하여 상온에서 하루 동안 교반시킨다. 얇은 층 크로마토그래피를 통해 반응의 여부를 확인하고 용매를 모두 감압 제거한다. MeOH와 CHCl3을 50 mL씩 3회 첨가하여 용매 제거를 반복하여 남아있는 trifluoroacetic acid을 모두 제거한다. 건조된 생성물을 소량의 MeOH에 녹여 차가운 diethyl ether에 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는다. 얻어진 침전물을 필터하고 diethyl ether로 3회 더 씻어내어 진공 건조하여 하얀색 가루의 생성물을 얻는다. Yield : 0.9g (72.2%). 1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.43 (s, 1H, NH), 8.14 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.57 – 7.52 (m, 1H), 7.48 – 7.42 (m, 1H), 3.48 (s, 6H), 3.08 (s, 5H), 2.80 (d, J = 54.2 Hz, 11H). HR-FABMS (m/z): calcd for C27H35O5N6S, 555.2390 ([M+H]+); found, 555.2393 ([M+H]+).

(3) L3(참고. Scheme 3)

L3는 다음과 같은 일련의 중간체 합성 경로를 통하여 최종 합성 되었다:

① [2-(2-tert-Butoxycarbonylamino-ethylamino)-ethyl]-carbamic acid tert-butyl ester] (1)

Tert-butanol (14.75 mL, 154.18 mmol)을 toluene (550 mL)에 녹인 후 KOH (0.43 g, 7.71 mmol)와 1,1’-carbonyldiimidazole (25 g, 154.18 mmol)을 넣어준다. 3시간 가량 60℃에서 열을 가해주며 교반한 후 상온으로 식혀준다. Diethylenetriamine (8.33 mL, 77.09 mmol)을 C6H5CH3 (50 mL)에 녹인 후 천천히 적가한다. 60℃에서 다시 3시간 가량 교반한 후 용매를 제거한다. 투명한 오일 상태의 반응물을 CH2Cl2에 녹인 후 물로 세척한다. 세척 된 유기층을 Na2SO4를 사용하여 탈수 한 후, 용매를 제거하고 진공 건조 한다. Yield: 20 g (85 %), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.21(dd, J = 11.2, 5.6 Hz, 4H), 2.72(t, J = 5.8 Hz), 1.44(s, 18H).

② 2-(Acryloyl-(2-tert-butoxy carbonylamino-ethyl)-amino-ethyl)-carbamic acid tert-butyl ester (2)

화합물 1 (1.2 g, 3.96 mmol)을 CH2Cl2 (50 mL)에 녹인 후 triethylamine (1.65 mL, 11.84 mmol)을 넣어준다. CH2Cl2 (20 mL)에 Acryloyl chloride (0.38 mL, 4.8 mmol)를 넣고 0℃ 에서 천천히 적가한 뒤, 상온에서 18 시간 가량 교반한다. 용매를 제거한 반응물을 CH2Cl2/MeOH 조건에서 칼럼크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 노란빛의 오일을 얻는다. Yield: 1.03 g (73%) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.56(dd, J = 16.6, 10.4 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 16.6, 1.9 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 10.4, 2.0 Hz, 1H), 3.46 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 3.34 – 3.12 (m, 4H), 1.36 (d, J = 2.5 Hz, 18H).

③ L3.

화합물 2 (6.5 g, 18.2 mmol)를 CH2Cl2 (10 mL)에 녹인 후 trifluoroacetic acid (10 mL, excess)를 첨가한다. 18 시간가량 상온에서 반응시킨 후 용매를 제거 하고 남은 trifluoroacetic acid를 제거하기 위해 EtOH (50 mL)를 넣어 다시 용매를 제거한다. 위의 과정을 3회 가량 반복한 후 진공 건조한다. 상기 반응물을 MeOH (800 mL)에 다시 녹인 후 triethylamine (5.07 mL, 36.37 mmol) 을 넣는다. DTPA-Bis-anhydride (6.5 g, 18.2 mmol)가 녹아 들어가는 것을 확인하며 고체 상태로 조금씩 첨가한 후 24 시간 동안 반응한다. 녹지 않은 반응물을 여과한 후 용매를 제거하고 0.1 N NaOH 수용액 (80 mL)을 넣고 다시 용매를 제거한다. 3회에 걸쳐 반복한다. 반응물을 메탄올에 진하게 녹인 뒤 짧은 실리카겔 칼럼에 통과시켜 분리 정제한다. 분리된 반응물 용액의 부피를 줄인 뒤 Et2O에 침전시켜 흰색의 고체로 얻어내어 진공 건조한다. 수율: 1.0 g (11%) FAB-MS(m/z): calcd for C21H34N6O9, 514.24; found, 515.6

(4) L4(참고. Scheme 4)

L4는 전체 다섯 단계를 거쳐 합성되었으며, 각 단계 별로 중간 화합물의 합성은 다음과 같다:

① Bisbenzyl 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,7-dicarboxylate (3)

Cyclen (5 g, 29.02 mmol)을 CHCl3 (50 mL)에 녹여 -4℃에서 benzyl chloroformate (8.7 mL, 60.95 mmol)를 2시간가량 적가한 후, 상온에서 18 시간가량 교반한다. 용매를 깨끗이 제거한 반응물에 Et2O를 이용해 세척하고 흰색 고체의 화합물을 여과한다. 얻어진 흰색 고체의 화합물에 다시 CHCl3을 넣은 후 3 N의 NaOH 수용액으로 3 회 가량 세척하여 유기 층을 회수한다. 얻어진 유기층에 MgSO4를 넣어 탈수 하고 여과하여 용매를 제거한 후 진공 건조한다. 수율: 10 g (78.2 %) 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 7.26-7.19 (m,10H), 5.04 (s, 4H), δ = 3.34-3.05 (m, 12H), 2.9-2.6 (m, 8H), 1.35 (s, 18H).

② Bisbenzyl 4,10-diacryloyl-1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,7-dicarboxylate (4)

화합물 3 (5.2 g, 11.80 mmol)을 MeCN (100 mL)에 녹여 diisopropylethylamine (10.28 mL, 59.02 mmol)을 넣은 후 0℃에서 acryloyl chloride (2.29 mL, 28.32 mmol)를 적가한다. 상온에서 18시간 반응한 후, 용매를 제거하고 칼럼크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 흰색의 고체를 얻는다(전개액, CH2Cl2:MeOH = 9:1). 수율: 3.13 g (48.4 %). LC-MS: exact Mass, 548.26; found, 549.34 ([M+H]+), 571.33([M+Na]+).

③ 1,1’-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,7-diyl)bis(prop-2-en-1-one) (5)

화합물 4 (3 g, 10.70 mmol)를 EtOH (80 mL)에 녹인 후, 여기에 10%의 Pd/C (0.3 g)을 넣고, H2 기체를 충전하여 24시간 동안 교반한다. 반응물을 Celite 패드를 통하여 여과하고, 여과액의 부피를 줄인 후에 Et2O에 침전하여 흰색의 고체를 얻는다. 추가적인 정제과정과 분석 없이 다음 단계에 사용하였다. 수율: 2.18 g (73 %).

④ Di-tert-butyl 2,2’-(4,10-diacryloyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,7-diyl)diacetate (6)

화합물 5 (2.48 g, 8.86 mmol)을 MeCN (80 mL)에 녹이고, 여기에 K2CO3 (3.67 g, 26.58 mmol)를 넣고 0℃에서 t-butyl bromoacetate (3.14 mL, 21.26 mmol)를 적가한다. 상온에서 18시간 교반 후, 무기염을 여과한 반응물의 용매를 제거한다. CH2Cl2:MeOH=95:5 조건에서 칼럼크로마토그래피를 이용하여 분리 정제한다. 수율: 2.8 g (62 %). LC-MS: exact Mass, 508.33; found, 509.39 ([M+H]+).

⑤ L4

화합물 6 (1 g, 1.97 mmol)를 CH2Cl2 (5 mL)에 녹인 후 trifluoroacetic acid (5 mL, excess)를 넣고 상온에서 24시간 교반한다. 남은 trifluoroacetic acid를 제거하기 위해 EtOH를 함께 넣고 용매를 제거한다. 위의 과정을 3 회 반복 후, MeOH에 진하게 녹인 반응물을 Et2O에 침전하여 갈색의 고체를 얻는다. 갈색의 고체를 다시 MeOH에 녹여 짧은 칼럼크로마토그래피를 통과시킨 후 용매를 제거하고, MeOH/Et2O 조건에서 침전하여 흰색의 고체를 얻는다. 수율: 0.25 g (32%). HR-FABMS(m/z): calcd for C18H28N4O6, 397.2087 ([M+H]+); found, 397.2084([M+H]+).

2) 상자성 금속 착물의 합성과 확인

(1) [Mn(L1)(H2O)] (Chart 2)

가지 달린 플라스크(100 mL)에 메탄올(15 mL)과 증류수(15 mL)를 취한 후, L1(1g, mmol)을 가한다. 용액을 교반하면서 1 M NaOH 용액을 소량씩 첨가하면서 pH를 6으로 맞춰준다. MnCl2(g, mmol)를 첨가하면서 pH를 6이 유지되도록 필요 시 NaOH 용액을 가한다. 첨가가 끝난 후 용액을 밤새 상온에서 교반한다. 이후 회전농축기로 용매를 제거하고, 황색 고형물을 얻는다. 이 물질을 소량의 물에 녹여 역상 플래시 칼럼(reverse flash column)을 통하여 분리하고, 용매를 제거한 후 원하는 생성물을 흰색 가루로 얻는다. Yield: g (32%). FABMS: Calcd. m/z 595.0331; Found: 595.0327.

(2) [Mn(L2)(H2O)] (Chart 2)

둥근 바닥 플라스크(100 mL)에 L2 (1 g, 1.1 mmol)를 넣고, MeOH 15 mL에 녹인다. MnCl2 (0.356 g, 1.8 mmol, 1 eq)을 넣어 완전히 녹인다. 이것을 60oC에서 하루동안 교반시켜주면 하얀 침전물이 생긴다. 생긴 침전물을 필터하여 차가운 MeOH와 diethyl ether로 씻어주어 건조하여 하얀 가루를 얻는다. Yield: 0.4g (37%). HR-FABMS (m/z): calcd for C27H33MnN6O5S, 608.1617 ([M+H]+); found, 608.1614 ([M+H]+)

(3) [Gd(L3)(H2O)] (Chart 2)

Gd(Ⅲ)acetate hydrate (0.32 g, 0.97 mmol) 수용액 (10 mL)을 리간드 (0.5 g, 0.97 mmol)에 첨가한 후, 70 ℃의 열을 가하여 48시간 교반시킨다. Celite 545를 이용하여 여과하고, 용매를 일부 제거하여 여과액의 부피를 줄인다. 레몬색의 수용액을 CH3COCH3에 침전시켜 흰색의 고체로 얻어낸 후 진공 건조한다. Yield: 0.53 g (81 %). HR-FABMS (m/z): calcd for C21H31GdO9N6, 670.1477([M+H]+); found, 670.1469.

(4) [Gd(L4)(H2O)2] (Chart 2)

이 착물은 [Gd(L3)(H2O)]의 합성과 같은 방식으로 이루어진다.

3) 상자기성 금속 착물(ML)의 특성 연구

(1) 자기 이완도(relaxivity) 측정

① 각 착물의 자기이완도(r1, r2 mM-1s-1)를 측정하였고, 이를 기존의 상용화 된 유사 조영제들의 값들과 비교하였다.

② 두 종류의 망간 착물의 자기 이완도는 기존의 유사 착물, [Mn(EDTA)(H2O)]와 [Mn(DO2A)(H2O)]의 그것과 크게 차이가 나지 않았다(Table 1). 이는 chelate와 conjugate를 이루고 있는 BTA의 영향을 크게 받지 않았음을 의미한다. 그리고 두 킬레이트 L1과 L2 간을 비교해 보면, 거대고리(macrocycle)를 이루는 L2를 포함하는 착물이 더 높은 자기이완율을 보여주고 있다.

③ 가돌리늄 착물 [Gd(L3)(H2O)]의 경우 Multihance®나 Primovist®의 경우처럼 킬레이는 열린 구조형의 DTPA 계열이기는 하나, L3는 그 구조가 다소 다른 것이 이는 DOTA처럼 일종의 거대고리로 간주할 수 있으며, 열역학적 안정성도 Multihance®나 Primovist® 등보다 더 놓을 것으로 예상된다(이 부분에 대한 연구가 현재 진행 중에 있음). 자기 이완도는 세 경우 모두 비슷한 범위의 값을 보여주고 있다(Table 1).

(2) in vivo 실험

① 본 연구에서 합성한 네 종의 착물에 대한 생화학적 분포(biochemical distribution)나 배출 경로(excretion pattern) 등에 대한 정보가 필수적인바, 먼저 [Mn(L1)(H2O)]과 [Mn(L2)(H2O)]에 대한 특성을 관찰하였다 (여타 착물들에 대해서는 현재 실험이 진행 중에 있다). Figure 7과 8은 각각 [Mn(L1)(H2O)]과 [Mn(L2)(H2O)]을 이용한 동물 실험 결과이다.

Figure 7. The excretion pattern for [Mn(L1)(H2O)] after

i.v. injection to normal mice of 6 weeks old

Figure 8. The excretion pattern for [Mn(L2)(H2O)] after

i.v. injection to normal mice of 6 weeks old

② 주사한 [MnL(H2O)] (L= L1, L2)의 양은 0.05mmol/kg이다. [Mn(L1)(H2O)]의 경우 간과 담낭, 그리고 방광에 조영 증강 효과가 나타남을 확인할 수 있고, [Mn(L2)(H2O)]는 간과 담낭에 조영 증강 효과가 나타남을 확인할 수 있다. 또한, [Mn(L1)(H2O)]과 [Mn(L2)(H2O)] 모두 주사 후 6시간 까지 조영 증강 효과가 나타남을 관찰할 수 있다(Figure 7, 8).

③ 동물 실험 결과에서 두 [MnL(H2O)] (L= L1, L2)의 조영 증강 정도를 시간에 따른 신호 대 잡음 비 변화(CNR)로 나타낸 결과를 Figure 9에서 확인할 수 있다. 그림에도 보듯, 두 착물 모두 10분 이내에 간이 밝아지는 양상을 보였고, [Mn(L2)(H2O)]의 경우, 한 시간 이내에 담낭의 신호 증강 효과가 최대로 나타남을 확인할 수 있다. 이 결과는 [Mn(L1)(H2O)]이 신장과 담관을 통해 배출되고, [Mn(L2)(H2O)]이 담관을 통해 배출됨을 의미한다.

④ [Mn(L1)(H2O)]과 [Mn(L2)(H2O)]의 생화학적 분포(biochemical distribution)이나 암 치료 효과에 대한 연구는 현재 진행 중이며, 차년도 보고서에서 보고할 예정이다.

Figure 9. Graphs of CNR as a function of time

(3) 반응속도론적 안정성(kinetic inertness)

① 조영제의 생체 내에서의 안정성, 즉 생체 이온들(Zn2+, Ca2+, 등)과의 교환반응(transmetallation) 속도에 정보는 조영제의 유용성을 결정짓는 중요한 파라미터이다.

② [Gd(L3)(H2O)]에 대한 안정성을 기존의 상용 조영제와 비교한 결과를 Figure 10에 도시하였다.

Figure 10. R1(t)/R1(0) for various Gd complexes as a function of time

③ 예측할 수 있듯이, Dotarem의 경우를 제외하면, 대부분 시간이 지남에 따라 초기 자기이완도 정도를 유지하지 못하고 떨어지는 것을 볼 수 있다. 감소의 폭이 가장 심한 조영제가 Omniscan®으로서, [Gd(L3)(H2O)]의 경우도 나머지 조영제에 비하면 안정성이 크게 미치지 못함을 확인할 수 있다.

④ 당연히 DOTA 계열의 L4가 크게 안정성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대되며, 이에 대한 실험이 현재 진행중으로서, 가까운 미래에 그 결과를 적절한 논문으로 발표할 예정이다.

라. 연구목표의 달성도

<표>

마. 연구성과

<표>

바. 대표적 연구성과

<표>

<표>

※ 지난 1년간 발표한(논문은 게재확정 포함, 특허는 출원 포함) 대표적 연구성과를 5건 이내로 기재함

※ 성과참여자수 : 해당 연구성과에 참여한 연구원수(논문의 경우 저자수, 특허의 경우 발명인 수 등)를 기재함

※ 역할 : 논문(제1저자, 교신저자, 참여저자), 특허(단독, 공동), 기타(해당 역할을 기재)

※ 특기사항 : 인용횟수나 우수논문수상 등과 같이 특별히 기술 할 필요가 있는 사항을 기재함

※ 상기의 대표적 연구성과에 대한 내용은(별첨1:대표연구성과) 서식에 따라 요약문을 작성함

※ IF는 JCR 2014기준으로 작성

사. 연구수행에 따른 문제점 및 개선방향

해당사항 없음

아. 중요 연구변경 사항

해당사항 없음

2. 차년도 연구계획

가. 국내외 관련분야의 환경변화

해당사항 없음.

나. 연구 목표 및 내용

1) 연구 목표 : 표적성 MR/Optical 이중 영상 조영제 개발

2) 알부민 표적성 이중 영상 조영제 (HSA-targeting Bimodal Probe) 개발

(1) 알부민 표적성 조영제는 혈액 내 체류 시간이 길다는 특징을 가지고 있으며, 그렇게 되기 위해서 무엇보다 분자의 크기 (또는 분자량)나 3차원적 기하구조가 큰 영향을 미친다. (참고. Figure 11)

Figure 11. Illustion of the effects of molecular size and shape of an MRI CA:

In vivo images of a mouse by (a) Extracellular & (b) HSA-targeting MRI CAs

(2) 저분자 가돌리늄-킬레이트 (GdL) 조영제의 경우 분자량을 크게 할 수 있는 방안으로서, (i) GdL-고분자 간의 공유결합체를 형성하거나 또는 (ii) GdL-단백질 간의 비공유결합적 상호작용을 만들어주는 것이다.

(3) 후자의 경우 비공유결합적 상호작용에 영향을 주는 세 가지 요는 분자의 친 지질성(lipophilicity), 정전기적 인력(electrostatic interaction), 및 입체화학(stereochemistry) 등이 있다.

(4) 현재 알려진 대표적인 알부민 표적성 MRI 조영제는 일명 MS-325로 알려진 Gd(DTPA) 계열의 음이온 착물이다(Figure 12).

Figure 12. The structure of MS-325, a HSA targeting MRI CA

(5) 본 연구에서는 MS-325의 구조적 원리를 원용하여 아래 세 가지 종류의 새로운 알부민 표적성 조영제를 개발할 것인바, 공통적인 구조적 원리는 다음과 같다: (i) MS-325에서 채택하고 있는 음이온 전하를 유지한다; (ii) MS-325에서 도입하고 있는 선형 킬레이트 DTPA 대신에 열역학적, 반응 속도론적, 및 생체적 안정성이 훨씬 양호한 DOTA 유도체를 도입한다, (iii) 저분자 외에 거대분자를 포함하는 MR/Optical 이중 영상 조영제도 개발한다.

(6) 개발 대상 조영제의 구조 (Figure 13)

① 단일 분자 Gd(DOTA-(NHR)2) 음이온 착물(Figure 13(A))

② 무기 고분자(또는 소 중합체) 음이온(Figure 13(B))

③ 이종 다핵 무기 고분자(또는 소 중합체) 음이온(Figure 13(C))

Figure 13. HSA targeting anionic (A) mononuclear and (B) inorganic homopolymeric MRI CAs,

and (C) inorganic co-polymeric MRI/Optical Bimodal CAs.

3) 간 표적성 이중 영상 조영제(Liver-targeting Bimodal Probe) 개발

(1) 간 조영을 위한 대표적인 두 종의 MRI CA의 구조적 원리는 알부민 표적을 위한 조영제의 그것과 흡사하다.

(2) 킬레이트로 DTPA를 채택하고 있으며, 착물의 전하는 음이온이다. 다만 리간드 골격에 친 지질성(lipophilicity)이 강한 벤질 유도체를 도입하고 있다는 점이 특기할 만하다(참고. Figure 14).

Figure 14. The structures of two liver targeting MRI CAs:

Gd(BOPTA)(left) and Gd(EOB-DTPA)(right)

(2) 이들이 보여주는 간 조영 영상본 연구에서는 이들 두 분자의 구조적 원리를 도입하되, 새로운 간 표적성 조영제를 개발할 것이다:

① 단일 분자 Gd(DOTA-(NHR)2) 음이온 착물(Figure 15(A))

② 무기 고분자(또는 소 중합체) 음이온(Figure 15(B))

③ 이종 무기 고분자(또는 소 중합체) 음이온(Figure 15(C))

Figure 15. Liver targeting anionic (A) mononuclear and (B) inorganic homopolymeric MRI CA,

and (C) inorganic co-polymeric MRI/Optical Bimodal CA.

(3) 간 표적(hepatocyte-uptake)의 특징은 Gd-BOPTA나 Gd-EOB-DTPA의 경우에서 보듯이, 담낭(膽囊)을 통해서 배출될 것이므로 이를 MRI를 통해서 확인할 수 있을 것이다(Figure 16).

Figure 16. Excretion via gallbladder demonstrating hepatocyte-uptake as evidenced by MRI

4) 효소 표적성 이중 영상 조영제(Enzyme-targeting Bimodal Probe) 개발

(1) 특정 암세포에서 발현하는 “세포외 기질 분해 효소” (matrix metalloproteinases, MMPs)를 선택적으로 인지하는 MRI 조영제를 개발한다. 이는 일종의 생체분자 스위치 (Biomolecular switch) 기능을 수행할 것이다.

(2) MMPs는 “세포외 기질” (extracellular matrix components, ECM)을 분해하는 기능을 지닌 효소로서, 24개의 단백질이 하나의 군을 이루고 있다. 이들 효소는 정상 세포 내에서도 존재하지만, 암세포에서 주로 발현하여 세포외 기질을 분해하는 과정에서 집중적으로 간여한다. 이들 중에서 MMP-2, MMP-9, 그리고 MMP-11 등이 주로 인간의 암세포에서 다양하게 나타나고 있는데, 본 연구에서는 주로 MMP-2에 의한 분해 작용을 MRI 조영제를 이용하여 규명할 것이다.

(3) 암 치료를 가장 어렵게 하는 것은 암세포의 전이(metastasis)이다. 이 때 세포를 둘러싸고 있는 조직으로 침입해 들어가는 세포 침윤(invasion)과정이 필수적이며 이는 악성 암세포의 특징 중 하나이다. 침윤성에는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane)을 분해하는 단백질 분해과정과 분해된 기질을 통하여 이동하는 세포 이동성(migration)이 관여한다. ECM을 분해하는 단백질 분해 효소 중 대표적인 것이 matrix metalloproteinase (MMP)이며 이 중 특히 MMP-2와 MMP-9이 세포 침윤성에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다(참고. Figure. 17)

Figure. 17. The Role of MMPs in Metastasis

(4) 효소 표적성 영상 연구는 국외에서 일부 연구진에 의해서 이루어지고 있으나, 주로 광학 영상(Optical imaging) 기법을 이용한 것으로, MRI를 이용한 사례는 거의 알려지지 않고 있다. 기존 광 영상의 한계는 생체 내 투과 정도가 수 ㎛에 불과하여 소동물이나 인체의 경우 안구나 피부와 같이 표피부분에만 적용할 수 있는 결정적인 한계를 지니고 있다.

(5) 조영제 설계 원리: MMP 발현을 가장 효과적으로 감지할 수 있는 설계는 기질 단백질과 MR-조영 물질의 조합을 통해서 이루어질 수 있을 것이다. 즉 단백질의 절단 (cleavage) 여부에 따라 전체 생체분자 스위치의 용해성이 달라져, MR-조영제가 이 과정을 즉각적으로 감지할 수 있도록 하자는 것이다. 예컨대, 친수성 (hydrophilicity)이 큰 PEG (polyethylene glycol)을 포함하고 있는 지능형 분자 스위치가 MMP-2의 단백질 분해 작용에 의해, PEG를 포함한 일부가 절단되어, GdL을 포함하고 있는 부분의 친 지질성이 증가하여 암세포 내에 더 오래 머물러 있게 되며, R1-이완율이 증가하게 될 것이다. 한 마디로 MMP-2의 촉매 분해 작용으로 종양 세포 내의 MR-신호 증강 효과가 나타나게 되는 것이다. 아래 그림은 이를 도식적으로 잘 보여주고 있다 (Figure. 18 윗부분)

Figure 18. Illustration of catalytic cleavage of the SPAYTA sequence in biomolecular MRI-switch by MMP-2.1

(6) 합성 대상 및 과정: 세 단계에 걸쳐 이루어질 것인바, RGB의 각 색은 매 단계를 나타낸다(Figure 18).

① 1 단계: GdL과 친 지질성 (liphophilicity) 디아민(diamine) 연결자(spacer)의 연결

② 2 단계: SPAYTA 순서로 이루어진 펩타이드와 PEG와의 축합반응으로 SPAYTA-PEG 합성

③ 3 단계: GdL과 SPAYTA-PEG 간의 축합 반응

(7) 전체적으로 조영 물질 1은 세 개의 단위로 이루어져 있으며, 각기 고유한 기능을 수행하게 될 것이다.

(8) 조영물질 평가:

① 동물 대장암 모델을 이용하여 조영 물질 평가를 수행한다.

② MRI 영상 실험은 3T MR scanner에서 특수 자체 제작한 동물 전용 RF 수신 코일을 사용하여 영상 자료를 획득 할 것이다.

③ 비 특이성 조영물질과의 비교 실험: 지능형 MR 조영물질이 아닌 비 특이성 조영물질을 사용하여 동일한 실험을 반복한 후, 지능형 MR 조영물질에 의한 T1 조영효과와 비교 분석 작업을 수행한다.

(9) 조영물질 평가:

① 효소 표적성을 확인하기 위하여 조영물질을 꼬리정맥을 통해 주사하기 전후의 T1 강조영상을 획득하고, 조영증강 정도와 패턴을 분석한다(Figure. 19).

Figure. 19. T1-weighed MR images of mouse

in the absence of MMP-2 (upper) and in the presence of MMP-2 (below)

② 실험 대상 동물은 수컷 BALB/c-nu Slc 누드 마우스 (체중 20-25 g)를 사용하고 (N=4), 마취 후 (ketamine과 xylazine 혼합, i.m.) 왼쪽 하부 옆구리 피하에는 인간 대장암 세포주인 HT-29 세포를 이식하여 종양모델을 유도한다. 세포의 성장속도를 고려하여 HT-29 세포는 106 cells를 50 ㎕ 의 serum free 배지에 부유시켜서 주입한다. 세포 이식 4주 후에 종양의 직경이 5~7 mm 정도가 되었을때 MRI 영상 실험을 진행한다(Figure. 20).

Figure. 20. Experimental procedure for investigation of MMP-2 switchable MR agents with nude mouse

③ MRI 영상 자료는 3T MR scanner에서 특수 자체 제작한 동물 전용 RF 수신 코일을 사용한다. 지능형 MR 조영물질의 생체내 분자 스위치(MMP-2) 기능을 확인하기 위해 조영물질을 꼬리정맥을 통해 주사하기 전후의 T1 강조영상을 획득한 후 T1 조영증강 정도 및 패턴을 분석한다.

<표>

<표>

다. 연구추진내용

<표>

<표>

라. 연차점검 시 착안점 및 척도

상위 도표 참조

<표>

마. 기타 주요 변경사항

해당 사항 없음

<표>

3. 장비도입계획(3천만원 이상~1억원 미만인 경우에만 작성)

<표>

4. 연구실 안전 조치 이행 계획

가. 연구실 안전 조치 이행 계획

1) 기술적 위험 요소 분석

<표>

2) 안전 관리 대책

<표>

5. 참고문헌

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[별첨1]

〈 대 표 연 구 성 과 〉

<표>

〈 대 표 연 구 성 과 〉

<표>

〈 대표적 연구업적 사본 〉

[별첨2]

〈 연 구 비 총 괄 표 〉

(단위 : 천원)

<표>

※ 이 표는 변경 및 삭제가 불가능함

※ 연구기간은 아래를 참조하여 1~3차년도 기재 요망

- 2014년 최초 선정과제의 경우, 2014년이 1차년도, 2015년이 2차년도, 2016년이 3차년도임.

- 2015년 최초 선정과제의 경우, 2015년이 1차년도, 2016년이 2차년도, 2017년이 3차년도임.

※ 인건비 중 미지급은 연구비 총액에 포함하지 않음

※ 연구수당은 인건비(인건비로 계상된 지급·미지급인건비 및 학생인건비를 포함하되 정부출연연구기관 및 특정연구기관의 미지급인건비는 제외)의 20퍼센트 범위에서 계상함

※ 연구비는 천원 단위로 숫자만 기재하고 천원 단위 이하는 절사하며, 현물은 작성하지 않음

※ 신청서 (A101양식)의 출연금 합계와 본 양식 (A611)의 연도별 연구비 총액을 반드시 일치하여 기재함

(합계 불일치 시 업로드 에러 발생)

※ 신청 총 연구기간(표지 ⑩번)만큼 표지 ⑨번과 양식A611의 연차년도를 작성하여야 함.(예를 들어 연구기간 3년을 신청한 경우, 표지 ⑨번과 양식A611에도 3차년도까지의 연구비를 기재하여야 함)

※ <연구비총괄표>의 2016년 비목별 금액과 <연구개발비목별 소요명세(2016)>의 비목별 금액은 일치되게 작성

(비목별 금액이 일치하지 않는 경우 업로드 에러 발생)

[별첨3]

〈 연구개발비목별 소요명세 (2016년도) 〉

<표>

(가) 인건비

(가)-1 내부인건비

(단위 : 천원)

<표>

※ 참여시작일, 참여종료일 : 기재하지 않음

※ 소속기관 입력시 특정연구기관(KAIST, GIST, DGIST)인 경우 반드시 한글명칭(한국과학기술원, 광주과학기술원, 대구경북 과학기술원)으로 입력하셔야 합니다.

※ 직급 (연구소 해당)은 연구소에서 사용하는 명칭으로 기재함 :

원급(연구원급), 전임급(전임연구원급), 선임급(선임연구원급), 책임급(책임연구원급), 수석급(수석연구원급) 등

※ 직위(대학 해당)는 대학에서 사용하는 명칭으로 기재함(시간강사, 전임강사, 연구교수, 조교수, 부교수, 교수, 석좌교수 등)

※ 직위와 직급은 모두 기재하여야 함(예시 : 수석급 / 교수)

※ 국적 : 우리나라 국적인 경우 “대한민국”을 입력하고, 기타 국적이신 경우만 연구사업통합시스템(http://ernd.nrf.re.kr) 코드검색에서 ‘국가코드’를 검색하여 기재

※ 월급여 : 연봉 총액을 12개월로 나눈 값을 기재함

※ 참여율

- 정부출연기관 및 특정연구기관 등 : 연구원의 연봉총액을 100으로 할 때 해당 연구개발과제에서 연구원에게 지급될 인건비의 비율

- 인건비가 이미 확보된 기관(대학, 기업 및 국공립연구기관 등) : 실제로 해당 연구개발과제에 참여하는 정도

※ 지급구분 : 동 연구과제 연구비에서 인건비를 지급받는 경우에는 “지급”으로, 지급받지 않는 경우에는 “미지급”으로 기재함

- 정부출연연구기관 및 특정연구기관 등 소속 연구자의 경우, 연구수당 등 연동비목 계상을 목적으로 연구개발과제 참여율을 계상할 수 없음

- 단, 특정연구기관육성법 시행령 제3조제1호 내지 제3호에 해당하는 연구기관 소속 연구자의 인건비가 기 확보되어 해당 연구개발과제에서 별도의 인건비를 지급하지 않는 경우 과제당 30%이내에서 참여율계상이 가능하나, 해당 미지급인건비는 연구수당 계상 시 제외하여야 함

※ 총액의 경우, 자동계산되지 않으므로 직접 기재(천원 단위에서 절사, A611 내부인건비 금액과 미일치시 업로드 에러 발생)

＊총액 = 월급여 * 참여율 * 참여개월수

※ 쓰지 않는 행은 삭제 요망

(가)-2 외부인건비

(단위 : 천 원)

<표>

※ 동료급 교수는 참여불가

※ 참여연구원 및 연구보조인력만 기재(연구책임자는 기재하지 않음)

※ 상기 양식의 외부인건비는 지급인력에 대해서만 기재하며, 미지급 외부 인건비에 대해서는 A611(총괄표)에 해당 금액만 기재

※ 총액의 경우, 자동계산되지 않으므로 직접 기재(천원 단위에서 절사, A611 외부인건비(지급) 금액과 미일치시 업로드 에러 발생)

<표>

(나) 학생 인건비(학생 인건비 통합 관리 시행 기관인 경우) (통합 관리 미 시행 기관인 경우 삭제)

(단위 : 천 원)

<표>

(나) 학생 인건비(학생 인건비 통합 관리 미 시행 기관인 경우)(통합 관리 시행 기관인 경우 삭제)

(단위 : 천 원)

<표>

<표>

(나)-1 학생인건비 현황

* 학생인건비 하한선 적용안내 공지용 파일 참조

연구개발과제 참여 학생연구원 현황

<표>

1) 연구개발과제 협약일 기준, 학사/석사/박사/석박사통합과정 중 택일

2) ‘학생 요청’, ‘연구책임자 요청’ 중 해당사항이 있을 경우 기입,학생 요청 시 [별첨4] 양식, 연구책임자 요청 시 [별첨5] 양식을 첨부

(다) 연구장비․재료비

<표>

(단위 : 천원)

<표>

(라) 연구활동비

<표>

※ 연구활동비 합계가 A611의 연구활동비 금액과 일치하여야 함

(마) 연구과제추진비

<표>

※ 연구과제추진비 합계가 A611의 연구과제 추진비 금액과 일치하여야 함

(바) 연구수당

(단위 : 천원)

<표>

※ 연구수당 합계가 A611의 연구수당 금액과 일치하여야 함(미일치시 업로드 에러 발생)

<표>

※ 핵심연구 내 위탁연구 생성 금지

(3) 간접비 (비영리기관인 경우)

<표>

※ 간접비는 주관연구기관에 확인 후 기재

(3) 간접비 (영리기관인 경우)

(단위: 천 원, %)

<표>

(단위: 천 원, %)

<표>

<표>

※ 간접비는 주관연구기관에 확인 후 기재

<표>

[별첨4] 학생인건비 실지급액 하한선 적용 예외 요청서(참여학생용)

<표>

[별첨5] 학생인건비 실지급액 하한선 적용 예외 요청서(연구책임자용)

<표>